Slangegift indeholder enzymer, der hydrolyserer carboxylesterbindinger.Substraterne til hydrolyse er phospholipider, acetylcholin og aromatisk acetat.Disse enzymer omfatter tre slags: phospholipase, acetylcholinesterase og aromatisk esterase.Argininesterase i slangegift kan også hydrolysere syntetisk arginin eller lysin, men det hydrolyserer hovedsageligt proteinpeptidbindinger i naturen, så det hører til protease.De enzymer, der diskuteres her, virker kun på estersubstrater og kan ikke virke på nogen peptidbinding.Blandt disse enzymer er de biologiske funktioner af acetylcholinesterase og phospholipase vigtigere og er blevet fuldt ud undersøgt.Nogle slangegifte har stærk aromatisk esteraseaktivitet, som kan hydrolysere p-nitrophenylethylester, a - eller P-naphthalenacetat og indolethylester.Det er stadig ukendt, om denne aktivitet er produceret af et uafhængigt enzym eller en kendt bivirkning af carboxylesterase, endsige dens biologiske betydning.Når giften fra Agkistrodon halys Japonicus blev omsat med p-nitrophenylethylester og indolethylester, blev hydrolysaterne af p-nitrophenol og indolphenol ikke fundet;Tværtimod, hvis disse estere reagerer med cobra Zhoushan-underarten slangegift og Bungarus multicinctus slangegift, vil de hurtigt blive hydrolyseret.Det er kendt, at disse kobragifte har stærk cholinesteraseaktivitet, som kan være ansvarlig for hydrolyse af de ovennævnte substrater.Faktisk har Mclean et al.(1971) rapporterede, at mange slangegifte, der tilhører Cobra-familien, kan hydrolysere indolethylester, naphthalenethylester og butylnaphthalenester.Disse slangegifte kommer fra: kobra, sorthalset kobra, sortlæbet kobra, gylden kobra, egyptisk kobra, kongekobra, gylden kobra mamba, sort mamba og hvidlæbet mamba (D. aw kender stadig østlig rhombola klapperslange
Slangegiften kan hydrolysere methylindolethylester, som er substratet til bestemmelse af cholinesteraseaktiviteten i serum, men denne slangegift viser ikke cholinesteraseaktivitet.Dette viser, at der er en ukendt esterase i kobragift, som er forskellig fra cholinesterase.For at forstå arten af dette enzym er der behov for yderligere separationsarbejde.
1, Phospholipase A2
(I) Overblik
Phospholipase er et enzym, der kan hydrolysere glycerylphosphat.Der er 5 slags phospholipase i naturen, nemlig phospholipase A2 og phospholipase
A. , phospholipase B, phospholipase C og phospholipase D. Slangegiften indeholder hovedsageligt phospholipase A2 (PLA2), nogle få slangegifte indeholder phospholipase B, og andre phospholipaser findes hovedsageligt i dyrevæv og bakterier.Fig. 3-11-4 viser virkningsstedet for disse phospholipaser på substrathydrolyse.
Blandt phospholipaser er PLA2 blevet undersøgt mere.Det kan være det mest undersøgte enzym i slangegift.Dets substrat er esterbindingen på den anden position af Sn-3-glycerofosfat.Dette enzym findes i vid udstrækning i slangegift, bigift, skorpiongift og dyrevæv, og PLA2 er rigeligt i fire familieslangegifte.Fordi dette enzym bryder røde blodlegemer og forårsager hæmolyse, kaldes det også "hæmolysin".Nogle mennesker kalder også PLA2 hæmolytisk lecithinase.
Ludeeke fandt først ud af, at slangegift kan producere en hæmolytisk forbindelse ved at virke på lecithin gennem enzymer.Senere har Delezenne et al.bevist, at når kobragift virker på hesteserum eller æggeblomme, danner det et hæmolytisk stof.Det er nu kendt, at PLA2 direkte kan virke på phospholipiderne i erytrocytmembranen, ødelægge strukturen af erytrocytmembranen og forårsage direkte hæmolyse;Det kan også virke på serum eller tilsat lecithin for at producere hæmolytisk lecithin, som virker på røde blodlegemer for at producere indirekte hæmolyse.Selvom PLA2 er rigeligt i de fire familier af slangegifte, er indholdet af enzymer i forskellige slangegifte lidt anderledes.klapperslange (C
Slangegift viste kun svag PLA2-aktivitet.Tabel 3-11-11 illustrerer sammenligningen af PLA2-aktivitet af 10 hovedgifte fra giftslanger i Kina.
Tabel 3-11-11 Sammenligning af phospholipase VIII-aktiviteter af 10 slangegifte i Kina
Slangegift
Fedt frigivelse
alifatisk syre,
Cjumol/mg)
Hæmolytisk aktivitet CHU50/^ g * ml)
Slangegift
Frigive fedtsyrer
(^raol/mg)
Hæmolytisk aktivitet "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
elleve
Micracephal ophis
fem komma et nul
kalyspallas
8. 68
to tusinde og otte hundrede
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
tre komma otte to
hundrede og fyrre
Bnugarus fasctatus
7,56
to hundrede og firs
B. multicinctus
en komma ni seks
to hundrede og firs
Viper og russelli
syv komma nul tre
T, mucrosquamatus
et komma otte fem
Siamensis
T. stejnegeri
0, 97
（2） Adskillelse og oprensning
Indholdet af PLA2 i slangegift er stort, og det er varme-, syre-, alkali- og denatureringsstabilt, så det er nemt at rense og adskille PLA2.Den almindelige metode er først at udføre gelfiltrering på den rå gift, derefter udføre ionbytterkromatografi, og det næste trin kan gentages.Det skal bemærkes, at frysetørring af PLA2 efter ionbytningskromatografi ikke bør forårsage aggregering, fordi frysetørringsprocessen ofte øger ionstyrken i systemet, hvilket er en vigtig faktor, der forårsager aggregering af PLA2.Ud over de ovennævnte generelle metoder er følgende metoder også blevet vedtaget: ① Wells et al.② Substratanalogen af PLA2 blev anvendt som ligand til affinitetschromatografi.Denne ligand kan binde til PLA2 i slangegift med Ca2+.EDTA bruges mest som eluent.Efter at Ca2+ er fjernet, falder affiniteten mellem PLA2 og ligand, og den kan adskilles fra ligand.Andre bruger 30% organisk opløsning eller 6mol/L urinstof som eluent.③ Hydrofob kromatografi blev udført med PheiiylSephar0SeCL-4B for at fjerne spor PLA2 i cardiotoksin.④ Anti-PLA2-antistof blev brugt som ligand til at udføre affinitetschromatografi på PLA2.
Indtil videre er et stort antal slangegift PLAZ blevet renset.Tu et al.(1977) listede PLA2 oprenset fra slangegift før 1975. I de senere år er der hvert år rapporteret et stort antal artikler om adskillelse og oprensning af PLA2.Her fokuserer vi på adskillelse og oprensning af PLA af kinesiske lærde.
Chen Yuancong et al.(1981) adskilte tre PLA2-arter fra giften fra Agkistrodon halys Pallas i Zhejiang, som kan opdeles i sur, neutral og alkalisk PLA2 i henhold til deres isoelektriske punkter.Ifølge sin toksicitet er neutral PLA2 mere giftig, hvilket er blevet identificeret som præsynaptisk neurotoksin Agkistrodotoxin.Alkalisk PLA2 er mindre giftig, og sur PLA2 har næsten ingen toksicitet.Wu Xiangfu et al.(1984) sammenlignede karakteristikaene af tre PLA2'er, herunder molekylvægt, aminosyresammensætning, N-terminal, isoelektrisk punkt, termisk stabilitet, enzymaktivitet, toksicitet og hæmolytisk aktivitet.Resultaterne viste, at de havde lignende molekylvægt og termisk stabilitet, men havde signifikante forskelle i andre aspekter.I aspektet enzymaktivitet var syreenzymaktivitet højere end alkalisk enzymaktivitet;Den hæmolytiske virkning af alkalisk enzym på røde blodlegemer fra rotter var den stærkeste, efterfulgt af neutralt enzym, og surt enzym blev næsten ikke hæmolyseret.Derfor spekuleres det i, at den hæmolytiske effekt af PLAZ er relateret til ladningen af PLA2-molekyle.Zhang Jingkang et al.(1981) har lavet Agkistrodotoxin-krystaller.Tu Guangliang et al.(1983) rapporterede, at en giftig PLA med et isoelektrisk punkt på 7,6 blev isoleret og oprenset fra giften fra Vipera rotundus fra Fujian og dets fysiske og kemiske egenskaber, aminosyresammensætning og sekvensen af 22 aminosyrerester ved N. -terminal blev bestemt.Li Yuesheng et al.(1985) isolerede og oprensede en anden PLA2 fra giften fra Viper rotundus i Fujian.Underenheden af PLA2 * er 13 800, det isoelektriske punkt er 10,4, og den specifikke aktivitet er 35/xnioI/miri mg。 Med lecithin som substrat er enzymets optimale pH 8,0, og den optimale temperatur er 65 °C LD5 injiceret intravenøst i mus.Det er 0,5 ± 0,12 mg/kg.Dette enzym har tydelige antikoagulerende og hæmolytiske virkninger.Det giftige PLA2-molekyle består af 123 rester af 18 slags aminosyrer.Molekylet er rigt på cystein (14), asparaginsyre (14) og glycin (12), men indeholder kun én methionin, og dets N-terminale er serinrest.Sammenlignet med PLA2 isoleret af Tuguang er molekylvægten og antallet af aminosyrerester af de to isoenzymer meget ens, og aminosyresammensætningen er også meget ens, men antallet af asparaginsyre- og prolinrester er noget anderledes.Guangxi king cobra slangegift indeholder rig PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) isolerede en PLA2 fra giften, som har en specifik aktivitet 3,6 gange højere end den oprindelige gift, en molekylvægt på 13000, en sammensætning på 122 aminosyrerester, et isoelektrisk punkt på 8,9 og god termisk stabilitet.Fra elektronmikroskopobservation af virkningen af basisk PLA2 på røde blodlegemer, kan det ses, at det har tydelig effekt på menneskelige røde blodlegemers membran, men ikke har nogen åbenlys effekt på gederøde blodlegemer.Denne PLA2 har tydelig retarderende effekt på den elektroforetiske hastighed af røde blodlegemer hos mennesker, geder, kaniner og marsvin.Chen et al.Dette enzym kan hæmme blodpladeaggregation induceret af ADP, kollagen og natriumarachidonsyre.Når PLA2-koncentrationen er 10/xg/ml~lOOjug/ml, hæmmes blodpladeaggregation fuldstændigt.Hvis vaskede blodplader blev anvendt som materialer, kunne PLA2 ikke inhibere aggregering ved en koncentration på 20 mg/ml.Aspirin er en hæmmer af cyclooxygenase, som kan hæmme virkningen af PLA2 på blodplader.PLA2 kan hæmme blodpladeaggregation ved at hydrolysere arachidonsyre for at syntetisere thromboxan A2.Opløsningskonformationen af PLA2 produceret af Agkistrodon halys Pallas gift i Zhejiang-provinsen blev undersøgt ved hjælp af cirkulær dikroisme, fluorescens og UV-absorption.De eksperimentelle resultater viste, at hovedkædekonformationen af dette enzym lignede den for den samme slags enzym fra andre arter og slægter, skelettets konformation havde god varmebestandighed, og den strukturelle ændring i det sure miljø var reversibel.Kombinationen af aktivator Ca2+ og enzym påvirker ikke miljøet af tryptofanrester, mens inhibitoren Zn2+ gør det modsatte.Den måde, hvorpå opløsningens pH-værdi påvirker enzymaktiviteten, er forskellig fra de ovennævnte reagenser.
I processen med PLA2-rensning af slangegift er et åbenlyst fænomen, at en slangegift indeholder to eller flere PLA2-elueringstoppe.Dette fænomen kan forklares som følger: ① på grund af eksistensen af isozymer;② Én slags PLA2 polymeriseres til en række PLA2-blandinger med forskellige molekylvægte, hvoraf de fleste er i området 9 000~40 000;③ Kombinationen af PLA2 og andre slangegiftkomponenter komplicerer PLA2;④ Fordi amidbindingen i PLA2 hydrolyseres, ændres ladningen.① Og ② er almindelige, med kun få undtagelser, såsom PLA2 i CrWa/w slangegift
Der er to situationer: ① og ②.Den tredje tilstand er blevet fundet i PLA2 i giften fra følgende slanger: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, palæstinensisk hugorm, sandhugorm og frygtelig klapperslange km.
Resultatet af tilfælde ④ får migrationshastigheden af PLA2 til at ændre sig under elektroforese, men aminosyresammensætningen ændres ikke.Peptider kan brydes ved hydrolyse, men generelt er de stadig bundet sammen af disulfidbindinger.Giften fra den østlige pit-klapperslange indeholder to former for PLA2, kaldet henholdsvis type a og type p PLA2.Forskellen mellem disse to typer PLA2 er kun én aminosyre, det vil sige, at glutamin i et PLA2-molekyle erstattes af glutaminsyre i det andet PLA2-molekyle.Selvom den nøjagtige årsag til denne forskel ikke er klar, menes det generelt, at det er relateret til deamineringen af PLA2.Hvis PLA2 i den palæstinensiske hugormegift holdes varm med den rå gift, vil endegrupperne i dens enzymmolekyler blive flere end før.Fra C PLA2 isoleret fra slangegift har to forskellige N-terminaler, og dens molekylvægt er 30.000. Dette fænomen kan være forårsaget af den asymmetriske dimer af PLA2, som ligner den symmetriske dimer, der dannes af PLA2 i giften fra den østlige diamondback klapperslange og western diamondback klapperslange.Den asiatiske kobra er sammensat af mange underarter, hvoraf nogle ikke er særlig bestemte i klassificeringen.For eksempel er det, der plejede at blive kaldt Cobra Ydre Kaspiske underart, nu anerkendt
Det skal tilskrives Cobraen fra det ydre Kaspiske Hav.Da der er mange underarter, og de er blandet sammen, varierer sammensætningen af slangegift meget på grund af forskellige kilder, og indholdet af PLA2 isozymer er også højt.For eksempel kobragift
Mindst 9 slags PLA2-isozymer af r^ll-arter blev fundet i, og 7 slags PLA2-isozymer blev fundet i giften fra cobra-underarten Caspian.Durkin et al.(1981) undersøgte PLA2-indholdet og antallet af isozymer i forskellige slangegifte, herunder 18 kobragifte, 3 mambagifte, 5 hugormegifte, 16 klapperslangegifte og 3 havslangegifte.Generelt er PLA2-aktiviteten af cobragift høj med mange isozymer.PLA2-aktiviteten og isozymerne af hugormegift er medium.PLA2-aktiviteten af mambagift og klapperslangegift er meget lav eller ingen PLA2-aktivitet.PLA2-aktiviteten af havslangegift er også lav.
I de senere år er det ikke blevet rapporteret, at PLA2 i slangegift eksisterer i form af aktiv dimer, såsom den østlige rhombophora klapperslange (C. slangegift indeholder type a og type P PLA2, som begge er sammensat af to identiske underenheder , og kun dimerase har
Aktivitet.Shen et al.foreslog også, at kun dimeren af PLA2 af slangegiften er den aktive form af enzymet.Studiet af rumlig struktur beviser også, at PLA2 af western diamondback klapperslange eksisterer i form af dimer.Fiskesædende sammensætning
Der er to forskellige PLA ^ Ei og E2 af slangegift, hvori 仏 findes i form af dimer, dimeren er aktiv, og dens dissocierede monomer er inaktiv.Lu Yinghua et al.(1980) studerede yderligere de fysiske og kemiske egenskaber og reaktionskinetik af E. Jayanthi et al.(1989) isolerede en basisk PLA2 (VRVPL-V) fra hugormegiften.Molekylvægten af monomeren PLA2 er 10.000, som har dødelige, antikoagulerende og ødemvirkninger.Enzymet kan polymerisere polymerer med forskellige molekylvægte under betingelse af PH 4,8, og polymerisationsgraden og molekylvægten af polymerer stiger med temperaturstigningen.Molekylvægten af polymeren genereret ved 96 ° C er 53 100, og PLA2-aktiviteten af denne polymer stiger med to
Indlægstid: 18. november 2022